장내 인간 장 상피의 3D 체외 형태 형성

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장내 인간 장 상피의 3D 체외 형태 형성

자연 프로토콜 17권,

Nature Protocols 17권, 910~939페이지(2022)이 기사 인용

13,000회 액세스

35 인용

8 알트메트릭

측정항목 세부정보

인간 장의 형태 형성은 3D 상피 미세 구조와 공간적으로 조직화된 선와 융모 특성을 확립합니다. 이 독특한 구조는 외인성 미생물 항원과 그 대사산물로부터 기저 선와의 줄기 세포 틈새를 보호함으로써 장의 항상성을 유지하는 데 필요합니다. 또한 장 융모와 분비 점액은 장 점막 표면에 보호 장벽을 갖춘 기능적으로 분화된 상피 세포를 나타냅니다. 따라서 3D 상피 구조를 재현하는 것은 시험관 내 장 모델을 구축하는 데 중요합니다. 특히, 유기모방형 내장칩은 생리학적 기능과 생체역학이 강화되어 장 상피의 자발적인 3D 형태형성을 유도할 수 있습니다. 여기에서 우리는 Transwell 내장 하이브리드 칩뿐만 아니라 미세유체 내장 칩에서 장 형태 형성을 강력하게 유도하는 재현 가능한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 장치 제조, Caco-2 배양 또는 미세 유체 플랫폼뿐만 아니라 기존 설정에서 장 오르가노이드 상피 세포의 배양, 3D 형태 형성 유도 및 여러 이미징 양식을 사용하여 확립된 3D 상피의 특성화에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 5일 이내에 기저측 유체 흐름을 제어하여 기능성 장 미세구조의 재생을 가능하게 합니다. 우리의 시험관 내 형태형성 방법은 생리학적으로 관련된 전단 응력과 기계적 운동을 사용하며 복잡한 세포 공학이나 조작이 필요하지 않으므로 다른 기존 기술에 비해 유리할 수 있습니다. 우리는 제안된 프로토콜이 생물 의학 연구 커뮤니티에 광범위한 영향을 미칠 수 있으며 생물 의학, 임상 및 제약 응용 분야를 위해 시험관 내 3D 장 상피층을 재생하는 방법을 제공할 수 있다고 생각합니다.

Gut-on-a-Chip1,2,3,4,5 또는 이중층 미세유체 장치6,7에서 배양된 장 상피 Caco-2 세포는 명확한 이해 없이 시험관 내에서 자발적인 3D 형태 형성을 겪을 수 있다는 것이 실험적으로 입증되었습니다. 기본 메커니즘. 최근 연구에서 우리는 배양 설정에서 기저측으로 분비되는 모르포겐 길항제의 제거가 필요하고 시험관 내에서 3D 상피 형태형성을 유도하는 데 충분하다는 것을 확인했으며, Caco-2와 환자 유래 장 오르가노이드 상피4로 검증되었습니다. 이 연구에서 우리는 Gut-on-a-Chip과 Transwell 인서트를 포함하는 변형된 미세유체 장치 모두에서 강력한 Wnt 길항제인 Dickkopf-1(DKK-1)의 세포 생산 및 농도 프로파일에 특히 중점을 두었습니다. '하이브리드 칩'이다. 우리는 Wnt 길항제(예: DKK-1, Wnt 억제 인자 1, 분비된 frizzled 관련 단백질 1 또는 Soggy-1)를 Gut-on-a-Chip에 외인성 첨가하면 형태 형성이 억제되거나 형태 형성이 중단된다는 것을 확인했습니다. 미리 구조화된 3D 상피층은 배양 중 길항적 압력이 시험관 내에서 장 형태 형성에 책임이 있음을 시사합니다. 따라서 상피 경계면에서 강력한 형태 형성을 위한 실용적인 접근법은 적극적으로 세척(예: Gut-on-a-Chip 또는 하이브리드 칩 플랫폼에서) 또는 확산을 통해 기저측 구획에서 Wnt 길항제의 수준을 제거하거나 최소한으로 유지하는 것입니다. 기저측면 배양액(예: Transwell 삽입물에서 웰의 대형 기저측 저장소까지).

이 프로토콜에서는 장내 칩 마이크로 장치 및 Transwell 삽입 가능 하이브리드 칩(1-5단계)을 제조하고 폴리디메틸실록산(PDMS) 기반 다공성 막(단계)에서 장 상피 세포를 배양하는 자세한 방법을 제공합니다. 6A, 7A, 8, 9) 또는 Transwell 삽입물의 폴리에스테르 막(단계 6B, 7B, 8, 9) 및 시험관 내에서 3D 형태형성을 유도합니다(단계 10). 우리는 또한 여러 영상 기법을 적용하여 조직 특이적 조직 형성 및 계통 의존적 세포분화를 나타내는 세포 및 분자 특성을 식별합니다(단계 11-24). 우리는 Caco-2와 같은 인간 장 상피 세포 또는 장 오르가노이드를 사용하여 다공성 막의 표면 변형, 2D 단층 생성 및 장의 생화학적 및 생체 역학적 미세 환경 요약을 포함한 기술적 세부 사항을 갖춘 두 가지 배양 형식 모두에서 형태 형성을 유도합니다. 시험관. 2D 상피 단층에서 3D 형태형성을 유도하기 위해 우리는 배양 배지를 배양물의 기저측 구획으로 흘려 두 가지 배양 형식 모두에서 형태형성 길항제를 제거합니다. 마지막으로, 우리는 모르포겐 의존성 상피 성장, 종방향 숙주-미생물 공동 배양, 병원체 감염, 염증 손상, 상피 장벽 기능 장애 및 프로바이오틱 기반 치료법을 시뮬레이션하는 데 잠재적으로 사용될 수 있는 재생 3D 상피층의 유용성에 대한 대표적인 예를 제공합니다. 효과.

95% coverage in a flask) to prepare a dissociated cell suspension by trypsinization (Box 2). Human intestinal organoids derived from intestinal biopsies or surgical resections are cultured in a dome of Matrigel scaffold plated in a 24-well plate to support the structural microenvironment. Culture medium that contains essential morphogens (e.g., Wnt, R-spondin and Noggin) and growth factors, prepared as described in Box 3, is replenished every other day until the organoids grow up to ~500 µm in diameter. Fully grown organoids are harvested and dissociated into single cells for a seeding into a gut-on-a-chip or on a Transwell insert (Box 5). As we previously reported, diverse intestinal organoid lines can be established and used depending on the disease type12,13 (e.g., ulcerative colitis, Crohn's disease, colorectal cancer or normal donors), the site of lesion (e.g., diseased versus nondiseased region) and the location in the GI tract (e.g., duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon or rectum). We provide an optimized protocol in Box 5 for culturing colonic organoids (colonoids) that typically require a higher concentration of morphogens than small intestinal organoids./p>

4 h./p>4 h./p>12 h to make a complete gut-on-a-chip device (Fig. 2f)./p>4 h to produce a complete hybrid chip device (Fig. 2h)./p>90% that does not cause any leakages due to the misalignment. However, the success rate may vary depending on the level of proficiency in the fabrication process and training. See Table 1 for troubleshooting./p>

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